Práctica 15: DiaClon Type + Screen

OBJETIVO

Comprobar el grupo sanguíneo ABO y RhD y verificar la presencia de anticuerpos irregulares

REACTIVO

·         1 microtubo que contiene anti-A monoclonal [línea celular A5]

·         1 microtubo con anti-B monoclonal [línea celular G½]

·         1 microtubo con anti-D monoclonal [líneas celulares LHM59/20 (LDM-3) + 175-2]

·         3 microtubos con antiglobulina humana poliespecífica (anti-IgG de conejo y anti-C3d monoclonal, línea celular C139-9)

·         Conservante: < 0,1% NaN3.

Todos ellos incluído en la matriz gel de la tarjeta ID-Card ˝DiaClon Type + Screen˝

·         ID-DiaCell I-II-III para el escrutinio de anticuerpos

·         ID-Diluent 2: LISS modificada para suspensiones de eritrocitos.

La antiglobulina humana anti-lgG includia en la tarjeta ID-Card ˝DiaClon Type + Screen˝ no es específica únicamente para las cadenas pesadas, por lo cual puede también reaccionar con las cadenas ligeras kappa (k) y lambda (l) de las moléculas IgA e IgM.

MATERIAL

·         Micropipetas

·         Puntas de pipeta

·         Incubadora a 37ºC

·         Tubos para las suspensiones

·         Centrífuga

MUESTRA

Sangre preferiblemente recién extraída

PROCEDIMIENTO

 

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE SANGRE

a) Suspensión de hematíes (para la determinación ABO/D)

Preparamos una suspensión de hematíes al 5% en el ID-Diluent 2:

Dejamos que el diluyente alcance la temperatura ambiente antes de utilizarlo.

Pipeteamos 0,5 ml del ID-Diluent 2 en un tubo limpio y agregamos 50 μl de sangre total o 25 μl de concentrado de hematíes, mezclando cuidadosamente.

b) Plasma o suero para el escrutinio de anticuerpos.

Cuando las muestras no vayan a analizarse inmediatamente deben conservarse a 2–8 °C después de la separación durante un máximo de 48 horas, y después a -20 °C según los criterios/directrices locales/nacionales.

PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA

1. Identificamos la tarjeta ID-Card

2. Retiramos la lámina de sellado sólo de los microtubo que se vayan a utilizar manteniendo la tarjeta ID-Card en posición vertical.

Pipeteamos 10  μl de la suspensión de hematíes del paciente en los primeros 3 microtubos (anti‑A, anti-B, anti-D) de la tarjeta-ID.

Pipetamos 50 μl de cada ˝ID-DiaCell I-II-III˝ en los microtubos 4, 5 y 6 (3 x AHG).

Agregamos 25 μl de plasma o de suero del paciente en los microtubos 4, 5 y 6.

Incubamos la tarjeta ID-Card durante 15 minutos a 37 °C en la ID-Incubadora.

Centrifugamos la tarjeta ID-Card durante 10 minutos en la ID-Centrífuga.

Leemos y anotar las reacciones.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Positivo: Los hematíes aglutinados forman una línea roja sobre la superficie del gel o están repartidos en el gel.

Negativo: Sedimento compacto de hematíes en el fondo del microtubo.

 Una reacción negativa indica la ausencia de anticuerpos irregulares detectables en el suero o plasma del paciente.

Una reacción positiva indica la presencia de anticuerpos irregulares. Escribir los resultados de la reacción en la tabla de antígenos.

Práctica 14: Tarjeta diaclon

OBJETIVO

Determinar los grupos sanguìneos ABO/Rh combinado con la prueba inversa o grupo sérico

REACTIVOS

La tarjeta ID-Card ˝DiaClon ABO/D + Reverse Grouping˝ contiene:

·         anti-A monoclonal [línea celular A5]

·         anti-B [línea celular G½]

·         anti-D [líneas celulares LHM59 / 20 (LDM3) + 175-2]

Todo ello en la matriz de gel.

·         El microtubo (ctl) es el control negativo.

·         La tarjeta-ID contiene también dos microtubos con gel neutro que sirven para la prueba inversa del grupo sanguíneo con hematíes A1 y B.

·         Conservante: < 0,1% NaN3.

·         ID-Diluent 2: LISS modificado para la preparación de las suspensiones de hematíes.

·         Hematíes-tests: ID-DiaCell A1 + B en una suspensión al 0,8%, en viales de 10 ml, listos para su uso.

MATERIAL

·         Micropipetas

·         Puntas de pipeta

·         Tubos para las suspensiones

·         Centrífuga

MUESTRA

Sangre preferiblemente recién extraída

PROCEDIMIENTO

Preparación de la muestra de sangre

a) Para la determinación de ABO/D

Preparamos una suspensión de hematíes al 5% en ID-Diluent 2 como sigue:

Dejamos que el diluyente alcance la temperatura ambiente antes de su utilización.

1.       Pipetamos 0,5 ml de ID-Diluent 2 en un tubo limpio.

2.       Agregamos 50 μl de sangre total o 25 μl de concentrado de hematíes, mezclando cuidadosamente.

La suspensión de hematíes puede utilizarse inmediatamente.

b) Suero o plasma para el sérico o contraprueba

Procedimiento de la prueba

1.       Identificamos la tarjeta ID-Card

2.       Retiramos la lámina de sellado sólo de los microtubo que se vayan a utilizar manteniendo la ID-Tarjeta en posición vertical.

3.       Pipetamos 50 μl de ˝ID-DiaCell A1˝ en el microtubo 5 (A1) y 50 μl de ˝ID-DiaCell B˝ en el microtubo 6 (B).

4.       Agregamos 50 μl plasma / suero del paciente en los microtubos 5 y 6. Se recomienda una incubación de 10 minutos a temperaura ambiente

5.       Agregamos 10 μl de la suspensión de hematíes del paciente en los microtubos 1–4 (A, B, D, ctl).

6.       Centrifugamos la tarjeta ID-Card durante 10 minutos en la ID-Centrífuga.

7.       Leemos y anotamos las reacciones.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Positivo: Los hematíes aglutinados forman una línea roja sobre la superficie del gel o están repartidos en el gel.

Negativo: Sedimento compacto de hematíes en el fondo del microtubo.

Práctica 13: Determinación del antígeno Du

OBJETIVO

Poner de manifiesto el Ag D^u (Ag D débil) mediante prueba de Coombs indirecta enfrentando hematíes problema a un suero anti-D específico comercial y, posteriormente, al reactivo de Antiglobulina humana (AGH)

MATERIAL

·         Material para lavado y dilución de hematíes.

·         Tubo de hemólisis.

·         Pipeta Pasteur.

·         Baño termostático.

REACTIVOS

·         AGH

·         SF

·         Suero anti-D

MUESTRA

Hematíes problema Rh-

 

PROCEDIMIENTOS

1-. PREPARACIÓN DE OS HEMATÍES PROBLEMA Rh -

Realizamos un lavado y una dilución al 5% de los hematíes problema tipados Rh-  y realizamos la prueba de Coombs directa sobre los hematíes problema tipados Rh-.

2-. DETERMINACIÓN DE COOMBS INDIRECTO

En un tubo de hemólisis depositamos 2 o 3 gotas del reactivo anti-D y le añadimos unas 2 o 3 gotas de la suspensión al 5% de hematíes problema Rh- (Agitamos suavemente)

Posteriormente incubamos la mezcla en baño termostático durante 15-30min

Una vez pasados los 15-30 minutos lavamos la mezcla con 1 ml de SF.

El lavado lo repetimos 2 veces más.

Al sedimento obtenido con el último lavado añadimos dos o tres gotas de AGH y centrifugamos a 2.500rpm durante 1 minuto.

Resuspendemos el sedimento obtenido con el último lavado dando pequeños golpecitos en el fondo del tubo (si es necesario, añadir unas gotas de SF.) y observamos la presencia o ausencia de aglutinación en el visualizador (si es necesario, en el microscopio.)

 

RESULTADOS

LECTURA

Observación macroscópica de la aglutinación:

·         Presencia de aglutinación (+): Aparecen grumos rojos oscuros que flotan en el líquido.

·         Ausencia de aglutinación (-): Los hematíes permanecen en forma de suspensión homogénea de color rojizo.

 

 

OBSERVACIÓN

La prueba de Coombs directa sobre los hematíes Rh- siempre tiene que dar - y expresa que los hematíes problema no poseen anticuerpos sobre su membrana; si da + la prueba de Coombs indirecto para detectar el Ag Du no será válida.

Si la prueba de Coombs indirecto es positiva los hematíes problema pertenecerán definitivamente al grupo Rh+

Si la prueba de Coombs indirecto es negativa los hematíes problema pertenecerán definitivamente al grupo Rh-

 

Práctica 12: Determinación del fenotipo y genotipo más probable del grupo Rh

OBJETIVO

Investigar el genotipo más probable del sistema Rh enfrentando los hematíes problema a distintos sueros que contienen Anticuerpos dirigidos contra los Antígenos que componen el sistema Rh.

MATERIAL

·         Material para el lavado de hematíes.

·         Tubos para centrífuga

·         Pipetas Pasteur

·         Papel parafilm

·         Gradilla

·         Centrífuga

MUESTRA

 Suspensión de hematíes problema lavados al 5% en SF

PROCEDIMIENTO

Realizamos el lavado de hematíes de la muestra-problema y una dilución al 5% en SF.

Rotulamos los 6 tubos con las letras D, E, C, e, c y CD y depositamos 2 a 3 gotas del antisuero correspondiente y 2 a 3 gotas de la suspensión de hematíes problema.

Tapamos los tubos con papel parafilm y agitamos suavemente.

Posteriormente centrifugamos a 1.000 rpm durante 1 minuto y resuspendemos el sedimento de hematíes dando pequeños golpecitos en el fondo del tubo.

Finalmente observamos la presencia o ausencia de aglutinación en el visualizador (si es necesario, se observará en el microscopio.)

RESULTADOS

LECTURA DE RESULTADOS.

·         Presencia de la aglutinación (+); aparecen grumos rojos oscuros que flotan en el líquido.

·         Ausencia de aglutinación (-); los hematíes permanecen en forma de suspensión homogénea de color rojizo.

 

 

Genotipo posible:

dce/dce

Fenotipo:

D - , E –, C –, e +, c +

 

OBSERVACIÓN

Para que la prueba sea válida, el autocontrol Rh debe dar aglutinación negativa.

 

Práctica 11: Determinación sérica del grupo ABO

OBJETIVOS

·         Determinar el grupo sérico del sistema ABO.

·         Detectar los anticuerpos (AC) dirigidos contra los antígenos del sistema ABO presentes en el suero.

MATERIAL

·         Tres tubos de hemólisis

·         Gradilla

·         Parafilm.

·         Pipetas de Pasteur desechables.

REACTIVOS

·         SF.

·         Hematíes tipificados del grupo A, grupo B y grupo AB como control positivo.

MUESTRA

·         Suero problema.

PROCEDIMIENTOS

1-.PREPARACION DE HEMATIES TIPADOS A, B y AB

Seleccionamos 3 muestras de sangre pertenecientes a los grupos A, B y AB e identificamos 3 tubos hemólisis con las letras A, B y AB.

Ponemos en los tubos de hemólisis 0,5 ml de sangre de cada una de las muestras,  llenamos hasta arriba los tubos con SF y tapamos con parafilm. (Agitamos para que se mezcle bien la sangre con el SF)

Centrifugamos durante 5 min a 2500 rpm y una vez que ha finalizado la centrifugación extraemos el sobrenadante de cada tubo con una pipeta de Pasteur especial para cada uno de ellos.

Volvemos a llenar hasta arriba los tubos con SF y lo llevamos a la centrifuga (repetirlo 3 veces en total)

Del sedimento de hematíes obtenido del último lavado y centrifugación de cada uno de los tubos A, B Y AB, cogemos con una micropipeta 0,1 ml y lo depositamos en 3 tubos pequeños identificados con A, B y AB.

1.       Añadimos 1,9 ml de SF a cada uno de los tubos.

2.       Los tapamos con parafilm y guardamos en la nevera hasta su utilización.

2-.DETERMINACION SERICA DEL GRUPO ABO

Identificamos 4 tubos pequeños con las letras A, B, AB y C y con una pipeta de Pasteur le añadimos 3 o 4 gotas del suero problema en cada uno de ellos.

Añadimos 3 o 4 gotas de los hematíes tipados anteriormente A, B y AB en sus tubos correspondientes y mezclamos bien mediante agitación suave.

Finalmente centrifugamos a 2500 rpm durante 1 min y  observamos la aglutinación de los tubos en el visualizador, y si es preciso, en el microscopio.

RESULTADOS

LECTURA DE RESULTADOS

Para observar aglutinación en los tubos debemos golpear suavemente en el fondo de los tubos con el dedo índice y medio para despegar los hematíes y observar mejor la aglutinación:

·         Presencia de aglutinación (+): se forman grumos de color rojo en un líquido claro.

·         Ausencia de aglutinación (-): los hematíes se resuspenden homogéneamente al golpear el fondo del tubo.

 

OBSERVACIÓN

Al aglutinar en A, B y AB significa que tiene anticuerpos A y B en el suero por lo que su grupo sanguíneo será 0.